第二代脱氧核糖核酸测序技术，又称下一代测序技术（next generation sequencing，NGS）或大规模平行测序（massively parallel sequencing，MPS），是一种高通量技术，也是第一代DNA测序技术划时代变革的核心。它能够一次对数百万条DNA分子进行测序，具有大规模、高通量、短时间、低成本等特点，使得全基因组或全转录组的测序变得方便易行。
第二代DNA测序技术始于2005年。其主流平台包括罗氏制药454公司的GS FLX测序平台、Illumina公司的系列测序平台和ABI公司的固体测序平台等。
在理论研究方面，第二代脱氧核糖核酸测序技术可运用于肿瘤学、遗传学、免疫学、病原学、微生物学、寄生虫学、药学等多学科。在临床诊疗方面，该技术适用于基因水平的检测，并在感染性疾病诊断与产前诊断中发挥重要作用。
历史沿革
历史背景
DNA测序（DNA sequencing）作为一种重要的分子生物学实验技术，在生物学、医学等领域研究中有着广泛的应用。1953年，DNA双螺旋结构被沃森（Watson）和弗朗西斯·克里克（Crick）发现后不久，就有人报道过DNA测序技术，但是操作流程复杂限制了其推广。1977年，英国科学家桑格（Sanger）引入双脱氧核苷三磷酸（ddNTP），发明了具有里程碑意义的末端终止测序法，简称Sanger法。同年，美国的Maxam和Gilbert合作发明了化学降解法测定脱氧核糖核酸序列，又称Maxam-Gilbert测序法。这两种DNA测序方法的建立，使测序技术实现了第一次质的飞跃。
随着人类基因组计划的完成，以链终止法测序为代表的第一代DNA测序技术已不能满足生命科学和医学研究的需求，研究人员希望通过更廉价、更快捷的方法全面、深入地分析各类物种的基因组、转录组及其与蛋白质之间相互作用的关系，于是，第二代DNA测序技术（next-generation sequencing，NGS）应运而生。
发展过程
2005年底，罗氏454公司推出了革命性的基于焦磷酸测序法的高通量基因组测序系统——Genome Sequencer 20 System。2006年，Solexa公司推出了基于边合成边测序（sequencing by synthesis）方法的IG Genetic Analyzer第二代测序仪，并很快被Illumina公司收购。随后，ABI（ABI）加入第二代脱氧核糖核酸测序市场的竞争，并于2007年推出了SOLiD测序系统。
随着时间的推移，罗氏制药454公司的Genome Sequencer 20和ABI的固体测序系统逐渐被市场所淘汰，Illumina公司随后推出的一系列第二代测序仪因其具有高准确性、高通量、高灵敏度和低成本等突出优势最终占据了全球第一的第二代DNA测序市场份额。2015年，由深圳华大基因研究院研发的中国首款国产桌面型高通量基因测序仪BGISEQ-500问世，使得中国人在基因组学研究和应用方面不再受制于国际厂商的高价垄断，一举让中国成为少数几个掌握第二代DNA测序核心技术的国家之一。
技术平台
第二代脱氧核糖核酸测序技术主要包括罗氏制药454公司的GS FLX测序平台、Illumina公司的系列测序平台和ABI公司的固体测序平台等。
Roche 454测序技术
Roche 454测序系统是焦磷酸测序原理，也是第一个商业化运营的第二代测序技术平台。测序时，使用一种叫作“Pico Titer Plate”（PTP）的平板，它含有160多万个由光纤组成的孔，孔中载有化学反应发光所需的各种酶和底物。测序开始时，放置在四个单独的试剂瓶里的四种碱基，依照T、A、C、G的顺序依次循环进入PTP板，每次只进入一个碱基。如果发生碱基配对，释放一个焦磷酸。这个焦磷酸在各种酶的作用下，经过一个合成反应和一个化学发光反应，最终将荧光素氧化成氧化荧光素，同时释放出光信号，此反应释放出的光信号被仪器配置的高灵敏度CCD照相机实时捕获。只要有一个碱基和测序模板进行配对，就会捕获到分子的光信号；由此一一对应，准确、快速地确定待测模板的碱基序列。
454测序技术中，每个测序反应都在PTP板上独立的小孔中进行，大大降低了相互间的干扰和测序偏差。该技术最大的优势是平均读长可达400bp。缺点是无法准确测量同聚物的长度，比如当序列中存在类似于聚腺苷酸（Poly A）的情况时，测序反应会一次加入多个T，所加入的T的个数只能通过荧光强度推测，导致测序不准确，引起插入和缺失的测序错误。
Illumina平台测序技术
Illumina公司的测序技术基本原理是边合成边测序，先在脱氧核糖核酸片段两端加上序列已知的通用接头构建文库，文库加载到测序芯片流动槽（Flow cell）上，文库两端的已知序列与Flow cell基底上的Oligo序列互补，每条文库片段都经过桥式PCR扩增形成一个簇，碱基延伸过程中，每个循环反应只能延伸一个正确互补的碱基，根据四种不同的荧光信号确认碱基种类，保证最终的核酸序列质量，经过多个循环后，完整读取核酸序列。该测序技术是Solexa公司发展起来的，后被Illumina公司收购。测序过程主要分为以下4步：
脱氧核糖核酸文库构建：利用超声波把待测的DNA样本打断成片段，除了特殊要求外，大部分是打断为200～500bp长的序列片段，这些小片段的两端添加上不同的接头，构建出单链DNA文库。
流动槽：用于吸附流动DNA片段的槽道，当文库建好后，文库中的DNA通过Flow 细胞的时候会随机附着在其表面的通道上。每个Flow cell有8个通道（channel），每个通道的表面都附有很多接头，这些接头与建库过程中加在脱氧核糖核酸片段两端的接头相互配对，DNA在其表面进行桥式PCR扩增。
桥式PCR扩增与变性：以Flow cell表面所固定的DNA片段为模板，进行桥式PCR扩增。经过不断的扩增和变性循环，最终每个DNA片段都集集成簇，每一个簇含有单个DNA模板的多份拷贝，使达到碱基的信号强度放大到测序所需要的强度要求。
测序：采用边合成边测序的方法，向反应体系中同时添加DNA聚合酶、接头引物和带有碱基特异荧光标记的4种dNTP。这些dNTP的3'-OH被化学修饰所保护，每次只添加一个dNTP，dNTP被添加到合成链上后，所有未使用的游离dNTP和脱氧核糖核酸聚合酶被洗脱掉，再加入激发荧光所需的缓冲液，激发荧光发光信号，光学设备完成荧光光信号的记录，最后利用计算机分析将光信号转化为测序碱基，荧光信号记录完成后，再加入化学试剂淬灭荧光信号并去除dNTP的3'-OH保护基团，进行下一轮测序反应。
Illumina测序技术每次只添加一个dNTP，能够很好地解决同聚物长度的准确测量问题，主要测序误差来源是碱基的替换，错误率在1%～1.5%之间。
SOLiD测序技术
SOLiD测序技术是2007年开始ABI公司用于商业测序应用的仪器。测序基本原理：该技术平台主要以四色标记的寡聚核苷酸连续的合成为基础，对单拷贝脱氧核糖核酸片段进行大规模的扩增和高通量并行测序。SOLiD测序样品制备过程中，首先物理破碎DNA，再连接通用接头，在乳液体系里进行大量扩增，单分子多拷贝的DNA分子聚集于微小磁珠上，将经过扩增的富含测序文库的磁性微珠固定于玻片表面进行测序反应。固体连接反应的底物是8碱基单链荧光探针混合物，连接反应时，探针依据碱基互补规则与单链DNA模板进行配对，探针的5'端分别标记四种荧光染料，3'端1～5位为随机碱基，其中1～2位构成的核苷酸碱基对表征探针染料类型的编码区，碱基编码矩阵规定此编码区16种碱基对和4种荧光的对应关系。通常进行五轮连续测序反应，每轮测序反应含有多次连接反应，每轮测序反应的第一次连接应由与引物区互补的“连接引物”介导，5种含有磷酸基团且位置上只相差一个碱基的连接引物可以介导连接测序反应的进行。每个磁珠上的单链模板相同，经过每次连接反应后产生相应的荧光信号，而起始位点的碱基是已知的，因此可以根据双碱基校正原则进行测序。“双碱基校正”是固体技术平台的一大特点，两个碱基确定一个荧光信号，相当于一次能决定两个碱基，因此也称之为双碱基测序法。
华大BGISEQ测序技术
2013年，深圳华大基因研究院收购了美国Complete Genomics公司，拥有了其全部测序专利、设备和软件平台，并在CG公司原有技术之上于2015年推出了BGISEQ-500基因测序仪。
文库制备：与Illumina“建库”策略不同，华大基因采取了一种环状“建库”的方式。首先，基因组脱氧核糖核酸经过片段化处理，再通过Klenow酶将黏性末端补齐为平行末端，用T4连接酶加上接头形成双链DNA片段，变性形成单链，并加入特殊的引物连接片段两端的接头，使之形成环状单链DNA。环状DNA构建好后立即进入下一步滚环扩增。
滚环扩增：滚环扩增的全称为环状DNA扩增（rolling circle amplification，RCA）技术，其目的与Illumina的“簇生成一样，使单个DNA片段扩增放大以达到测序仪器所需要的信号强度。滚环扩增是以环状单链脱氧核糖核酸为模板，通过一个短的DNA引物（与部分环状模板互补），在DNA聚合酶催化下将dNTP合成到环状DNA链上，由于DNA 聚合酶既有5'→3'聚合酶活性，又有3'→5'外切酶活性，就使得DNA聚合酶围绕着环不停地转圈，转圈的同时复制出上千份单克隆链，拷贝在一段DNA上，就像一段毛线团一样，这个毛线团被称为DNA纳米球（DNB，DNA Nano Ball），纳米球里包含着需要测序的样本片段。这种滚环扩增技术可将单链环状 脱氧核糖核酸 扩增102～103个数量级，其最大的优点是不同于PCR指数扩增，滚环扩增依赖于DNA聚合酶直线扩增，其扩增错误不会累积放大。
应用
随着人类基因组计划的完成和测序技术的不断发展，测序技术在生物学和医学各个领域的应用越来越广泛。在理论研究方面，第二代DNA测序技术可以运用于肿瘤学、遗传学、免疫学、病原学、微生物学、寄生虫学、药学等多学科。在临床诊疗方面，第二代DNA测序技术拥有传统PCR法测序所不具备的灵敏、精确、价廉、信息量大等优势，因而更适用于基因水平的检测。凭借依托高效的高通量测序平台，第二代脱氧核糖核酸测序技术在感染性疾病诊断、产前诊断（包括无创产前染色体病检测、胚胎植入前遗传学筛查与诊断）等方面发挥着重要作用。
产前诊断
《中国出生缺陷防治报告（2012）》指出，中国出生缺陷发生率在5.6%左右，且每年新增出生缺陷数约90万例。缺陷不仅影响患儿本身的生活质量及身体健康，还给家庭和父母心理带来沉重的负担。出生缺陷可分为染色体疾病、单基因和多基因疾病，其中，第二代DNA测序技术在染色体疾病检测上的应用效果最为显著。以唐氏综合征检测为例，唐氏综合征即21三体综合征，是由于多了一条21号染色体而导致的疾病，唐氏患儿每新发一例，给家庭造成的损失大约在100万元（2006年数据）。传统唐氏筛查的办法主要依靠血清学检测母亲外周血中的甲胎蛋白（AFP）、游离雌三醇（uE3）和人绒毛膜促性腺激素（HCG）水平，其准确率仅在70%左右，而诊断唐氏综合征的金标准——羊水穿刺属于有创检测，会有0.3%的流产风险，一般唐筛高风险才会选择进行。通过第二代脱氧核糖核酸测序技术对胎儿游离DNA的检测可以准确分析出宝宝是否患有唐氏综合征，其综合检出率>99%。第二代DNA测序技术在产前检测的全称是无创产前基因筛查（NIPT，non invasive prenatal DNA test），其最大优点是仅需要抽取5～10mL孕妇外周血就可以准确判断出宝宝是否患有唐氏综合征，提高了原有唐氏筛查的准确性，同时也避免了羊水穿刺带来的风险。除此之外，NIPT还可以检测胎儿其他染色体非整倍体的变异，例如18三体、13三体、X三体、X单倍体、克氏综合征等染色体的异常，为全球出生缺陷的防治提供了有力保障。
肿瘤精准诊断
2015年1月20日，时任美国总统奥巴马在国情咨文中提出了“精准医学计划”，其中，基于高通量测序技术的肿瘤测序是整个计划的核心部分。由于第一代脱氧核糖核酸测序技术需要单个基因逐一检测，既费时又消耗宝贵的肿瘤样本，因此，第二代DNA测序技术更加适合肿瘤的临床诊断。关于肿瘤的高通量基因检测，有两个主要的应用方向，一类是基于实体瘤的突变基因Panel测序，另一类是基于外周血或其他体液（如尿液、唾液等）的液体活检。
肿瘤基因Panel测序
基因Panel检测，即“基因组组合检测”，是第二代DNA测序技术所带来的一个新词语，它同时靶向检测多个基因上的多个位点，这些位点和基因需要按照临床疾病类型进行选择和组合，从而构成一个Panel。例如非小细胞肺癌患者，运用第一代测序仪仅能检测EGFR（表皮生长因子受体）基因上的几个主要突变位点，靶向药物耐药以后往往无计可施，而运用第二代脱氧核糖核酸测序技术则可以联合检测EGFR、KRAS（Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同源物）、BRAF（B-Raf原癌基因）、PIK3CA（磷脂酰肌醇4,5-二磷酸3-激酶催化亚基α）、ALK（间变性淋巴瘤激酶）、ROS1（c-ROS肉瘤致癌因子-受体酪氨酸激酶）等多个跟非小细胞肺癌相关的突变位点，为指导临床诊断和治疗提供了更多更全面的信息。2018年7月和8月，国家市场监督管理总局连续批准了两个基于高通量测序技术（NGS）多基因肿瘤突变联合检测试剂盒，标志着肿瘤基因Panel测序正式进入临床应用。
液体活检
液体活检（羧基液体丁腈橡胶 biopsy），也可称为“无创肿瘤脱氧核糖核酸检测”，是一种非侵入式的抽样，能监测肿瘤或转移灶释放到血液的循环肿瘤细胞（CTC）和循环肿瘤DNA碎片（ctDNA）。其中，ctDNA在肿瘤的早期诊断、动态监测、发生发展及疗效、复发风险评估等方面具有广阔的应用前景，受到越来越多的关注。ctDNA样本获取虽然相对简便，但在外周血中含量极低，只占血浆循环DNA的0.01%～1.00%，直到第二代DNA测序技术，数字化PCR技术和ARMS（扩增阻滞突变分析系统）技术的出现才解决了从极低度样本中检出ctDNA的难题。液体活检的临床应用有以下几个方向：
①肿瘤分期：肿瘤患者每一时期的CTC含量和ctDNA突变情况与患者的肿瘤进展密切相关，液体活检的实时监测可以辅助医生对患者病情的掌握。
②预后评估：已在多种肿瘤中发现CTC数目与预后密切相关，如果治疗效果好，CTC数量将会明显减少；效果不好，CTC数量变化很小。
③精准用药：研究表明ctDNA中的突变与肿瘤组织突变具有高度相似性，对血液中ctDNA的突变分析可以帮助医生判断患者肿瘤的突变类型，制订用药方案。
因此，基于第二代脱氧核糖核酸测序技术的液体活检技术为肿瘤筛查、诊断和临床决策提供了一种新的途径和机遇，具有巨大的应用潜力。
参考资料 >
二代DNA测序技术.《刑事技术》编辑部.2026-02-08
硬招迭出！华大发布纳米孔测序仪、基因检测多模态大模型，推出 “探极计划”.华大集团.2026-02-08